Según los (as) autores (as), la técnica empleada permite mapear el genoma viral con una resolución aproximadamente 25 veces mayor que con los métodos convencionales de secuenciación. De este modo, es posible tener una noción más precisa de la biología del patógeno y de cómo está evolucionando su genoma.

“Esto es sumamente prometedor, pues nos permite entender por qué hay cepas más virulentas o más capaces de escapar de la acción de nuestro sistema inmunitario, por ejemplo”, dice Marcelo Briones, investigador del Centro de Bioinformática Médica de la Escuela Paulista de Medicina (EPM-Unifesp) y coordinador de la investigación.

Tal como lo explica Briones, el SARS-CoV-2 es un virus de ARN de cadena simple, es decir que su material genético está compuesto por un solo filamento de nucleótidos, cuyas bases son la guanina, la adenosina, la citosina y el uracilo.

Para secuenciarlo aplicando el método convencional se echa mano de una técnica conocida con el nombre de RT-PCR (reacción en cadena de la polimerasa con transcriptasa reversa, por sus siglas en inglés), para convertir las moléculas de ARN en ADN (ácido desoxirribonucleico) complementario (ADNc), recordando que la molécula de ADN está formada por dos filamentos de nucleótidos.

En otras palabras, se elabora una copia complementaria de la cadena de ARN del virus. Luego se amplifican esas moléculas de ADNc (se generan miles de millones de clones) y se las secuencia. Entre las ventajas de esta estrategia figuran su rapidez y la posibilidad de efectuar la secuenciación incluso en muestras con poquísimo material genético.

“La secuenciación convencional de este virus implica algo así como intentar identificar a una persona viendo únicamente su sombra. En tanto, con el método que aplicamos en nuestro estudio, podemos observar directamente el ARN vírico tal como este existe "in vivo": es mucho más fidedigno”, afirma el investigador.

La metodología

Carla Braconi, docente del Departamento de Microbiología, Inmunología y Parasitología de la EPM-Unifesp y coautora del artículo, comenta que la investigación se concretó con uno de los primeros linajes del SARS-CoV-2 aislados en Brasil a comienzos del año 2020.

“Recibimos el aislado viral que nos envió el profesor José Luiz Proença-Módena [de la Universidad de Campinas] y cultivamos el patógeno en células vero [un linaje celular de riñón de mono altamente susceptible al SARS-CoV-2]. Luego efectuamos la extracción del ARN viral y lo secuenciamos con una tecnología portátil llamada MinION, de Oxford Nanopore Technologies”, comenta.

De acuerdo con Briones, el ARN se secuencia exactamente como sale de las células vero, sin pasar por RT-PCR o amplificación. “Únicamente le ‘colgamos’ un adaptador en la punta de la molécula y una cadena de ADNc para que la cadena de ARN se estire. Luego el ARN solamente va pasando por el secuenciador, base por base. Y cada tipo de base [citosina, guanina, adenosina o uracilo] y sus modificaciones, como la metilación, interrumpen el flujo eléctrico del aparato con un patrón diferente. Así es como identificamos cuál es cuál.”

Este proceso produce un gráfico que se asemeja al de un electroencefalograma, que posteriormente es interpretado con herramientas de bioinformática. A la secuencia final que se genera puede entonces comparársela con los modelos de referencia.

“De entrada, se tiene la impresión de que la secuencia obtenida tiene un montón de errores. Pero a decir verdad son las bases modificadas del ARN. Y algunas de esas modificaciones pasan desapercibidas cuando se efectúa la secuenciación convencional”, dice el investigador.

Este análisis, a cargo del posdoctorando João Campos, se enfocó en el patrón de metilación del ARN viral. En otras palabras, se apuntó a observar –entre las casi 30 mil bases que forman el ARN de cadena simple– cuáles recibieron el agregado de un radical metilo (CH3).

“Este tipo de modificación bioquímica en el ARN es sumamente importante para el funcionamiento adecuado de virus como el SARS-CoV-2, como así también en el de algunos arbovirus [entre ellos el del dengue y el del Zika], que integran el grupo 4 en el sistema de clasificación de Baltimore, compuesto por genomas virales con ARN de cadena simple y polaridad positiva”, comenta Braconi.

Los autores (as) explican que en general los ARN tienen alrededor de cien bases modificadas que son esenciales para realizar sus funciones biológicas.

“Después de que el SARS-CoV-2 entra en las células y las ‘obliga’ a hacer copias de su material genético, viene una enzima que efectúa la metilación de esos ARN y esas modificaciones pasan a tener una función. Forman parte de la información que el virus necesita para sobrevivir. Por ende, sin analizar ese patrón de metilación, no es posible conocer la riqueza genética real del SARS-CoV-2”, dice Briones.

Una base que frecuentemente se modifica en el ARN del SARS-CoV-2 es la N6-metiladenosina (m6A), que está involucrada en la evasión de la respuesta inmune.

“Esta modificación le permite al virus escapar del sistema de activación de los interferones [que son proteínas elaboradas por las células de defensa con acción antiviral]. Por eso constituye un blanco potencial para la creación de fármacos, y ya existen estudios que avanzan en tal sentido”, comenta Briones.

Se fuese posible crear un medicamento capaz de bloquear totalmente el proceso de metilación del ARN viral, según el investigador, el nuevo coronavirus desaparecería de las células y sería el fin del COVID-19.

“El problema radica en que, de bloquear la metilación en demasía, las células hospedantes también terminan muriéndose, pues las enzimas que metilan el ARN viral son las mismas que metilan los ARN de las células. Por eso debe ser algo con una acción sumamente específica.”

Una tecnología disruptiva

El grupo de la Unifesp fue pionero al realizar la secuenciación directa de ARN del SARS-CoV-2 acoplada a la identificación de las bases m6A. Este trabajo se realizó en el ámbito del Proyecto Temático titulado “Estudio de elementos inducidos por la respuesta vacunal en individuos sometidos a ensayos clínicos con la vacuna ChAdOx1 nCOV-19”, coordinado por el profesor Luiz Mario Janini. También participaron los investigadores (as) Juliana Maricato y Fernando Antoneli.

“En dos de los trabajos publicados anteriormente [por grupos del exterior], se realizó únicamente la secuenciación del ARN. En un tercero también se efectuó la secuenciación directa, pero se identificó la base 5mC. Existe a su vez un cuarto trabajo en el cual se identificó la misma base m6A, pero mediante otras técnicas que no involucran la secuenciación directa del ARN”, informa Briones.

Según el investigador, esta comprensión minuciosa acerca de cómo funciona el genoma del nuevo coronavirus,  les permite a los científicos (as) tener una idea más clara de cómo está evolucionando el patógeno.

“Quienes hablan de las mutaciones que el virus ha experimentado –que en sentido estricto corresponden a intercambios de una base por otra en la secuencia de ARN– están desde mi punto de vista,  sujetos al paradigma del ADN. Esto no tiene sentido, pues ese virus funciona en otra lógica. Nunca tiene ADN en su ciclo de replicación y, por consiguiente, referirse a ‘transcritos’ de este virus es un absurdo. El SARS-CoV-2 vive completamente en el mundo de ARN”, afirma Briones, al aludir a la hipótesis del RNA world, según la cual el mundo actual, con la vida basada principalmente en el ADN y en proteínas, fue precedido por un mundo en el cual la vida se basaba en ARN.

“El nivel de complejidad de la molécula de ARN es extraordinario, y con las nuevas tecnologías que hacen posible la secuenciación directa, se abre un nuevo universo de investigación. Estamos subiendo a ese tren al comienzo. Habrá un desarrollo muy grande por delante, pero ese es el camino que hay que seguir”, afirma.

El próximo paso en la Unifesp consistirá en secuenciar el ARN genómico de las variantes del SARS-CoV-2 identificadas recientemente, e investigar si existen diferencias significativas en el patrón de metilación.